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miRNA探針法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

簡要描述:

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更新時間:2024-01-15

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miRNA探針法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

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miRNA探針法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

20次反應

A-Tq3030

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40次反應

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5.png


PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

試劑:
模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產(chǎn)物;
設備:
PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進行PCR反應并得出準確結(jié)果。

PCR相關基礎實驗:

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。


6.pngPCR反應條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時間:

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合。復性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴增增加。

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